كل ما تريد معرفته عن تحليل ويسترن بلوت

ويسترن بلوت والتي تعرف أيضا باللطخة المناعي (Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية أو البروتينات المُتَنسِّخة حسب طول السلاسل البروتينية أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين.

والغرض الأساسي من إجراء تجربة لطخة ويسترن هو الكشف عن بروتين محدد داخل العينة التى تحتوى على بروتينات مختلفة، وتمكن الباحثون من التعرف على بروتينات محددة من وسط تراكيب بروتينية معقدة من الخلية.

كما أنها تزودنا بالكثير من المعلومات التفصيلية حول حجم هذا البروتين ووفرته النسبية داخل العينة المراد فحصها.

تحليل ويسترن بلوت

 

ما هو تحليل ويسترن بلوت

تم اختراع تحليل ويسترن بلوت في عام 1979 لهدف تحديد بروتينات ربط الحمض النووي الريبي الريبوزومي.

يتم عمل تحليل لطخة ويسترن في حالة الحصول على نتيجة إيجابية لداء لايم أو فيروس نقص المناعة البشرية، فقد يوصي الطبيبب باختبار لطخة ويسترن بعد اجراء تحليل اليسا (ELISA)

يبحث تحليل ويسترن بلوت عن الأجسام المضادة للعدوى، وليس العدوى نفسها، فعند اصابة الجسم بعدوى فيروسية أو فطرية أو بكتيرية ، فإنه سينتج بروتينات تسمى المستضدات استجابةً لذلك. تحفز المستضدات جهاز المناعة لطرد الأجسام المضادة في محاولة لمكافحة المرض.

اجراءات عمل تحليل ويسترن بلوت

اجراءات عمل تحليل ويسترن بلوت

  • اختبار لطخة ويسترن هو اختبار دم بسيط. لا يتطلب صياماً أو تحضيرًا بأي شكل من الأشكال.
  • مثل جميع اختبارات الدم ، قد تحتاج إلى ملء نموذج الموافقة أولاً.
  • يتم سحب عينة الدم في المختبر، ومن ثم ستحصل على نتائج الاختبار في غضون 4 أو 5 أيام عمل.
  • تمامًا مثل جميع اختبارات الدم ، لا توجد آثار جانبية خطيرة يمكن توقعها. قد يكون لديك قدر طفيف من الكدمات في موقع سحب الدم.

خطوات تحليل لطخة ويسترن Western blot analysis

الآن سنعرف كيف يتم تشخيص تحليل لطخة ويسترن؟

1- تجهيز العينة Preparing Samples

الخطوة الأولى فى التجربة هي تجهيز العينة ووضعها فى المادة الهلامية، وقد تكون العينة عبارة عن نسيج حيوي او خلية او سائل المراد استخراج بروتين معين منه ودراسته.

2- الفصل الكهربائي الهلامي Electrophoretic Separation of Proteins

الفصل الكهربائى الهلامي هو عملية فصل البروتينات حسب خواص معينة على الهلام باستدراج البروتينات نحو أقطاب كهربائية تساعد على فصل البروتينات المعينة ضمن الهلام تحضيراً لاستخدامات أخرى.

فبعد أن تكون العينة جاهزة للتحميل على الهلام لفصل البروتينات حسب الحجم يتم توليد مجال كهربي أعلى الهلام حتى يتم فصل العينات المشحونة.

3- نقل البروتينات إلى الغشاء Transferring Proteins to A Membrane

بعد إتمام مرحلة الفصل الكهربائى للهلام سوف ننتقل إلى المرحلة التالية وهى نقل البروتين إلى غشاء أكثر متانة. فى هذه الخطوة سوف نحتاج إلى إسفنج وورق ترشيح ومادة هلامية وغشاء بتم وضعه بين المادة الهلامية و القطب الموجب للبطارية.

4- مرحلة السد Blocking Nonspecific Sites

بما أنه تم اختيار الغشاء لقابليته للالتصاق بالبروتينات، وحيث أن كلاً من الأجسام المضادة والبروتينات المستهدفة هي عبارة عن بروتينات، لذلك من الضرورى أخذ بعض الاحتياطات لتجنب التفاعل بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم لاكتشاف البروتين المستهدف.

يتم منع الالتصاق بالبروتينات غير المستهدفة عن طريق وضع الغشاء في محلول مخفف من بروتين، وهذا البروتين يؤدي لحدوث عملية الإلتصاق بالغشاء في الأماكن التى لا تحتوي على البروتينات المستهدفة.

ولذلك بعد إضافة الجسم المضاد، سوف يلتصق بالاماكن التى يوجد بها البروتين المستهدف مباشرة فلن يكون هناك مكان اخر له ليلتصق به.

5- الاكتشاف Detection Methods

فى اثناء عملية الاكتشاف، نقوم بالتحقق من وجود البروتينات المطلوبة على الغشاء وذلك باستخدام جسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، والذي يسبب تفاعل لوني عند وضع مادة معينة عليه عند وضع مادة معينة عليه وينتوج لون معين. وينقسم تنفيذ هذه الخطوة إلى مرحلتين. 

ويتم إكتشاف البروتين على الغشاء بطرق مختلفة (chemiluminescence, chemifluorescence, fluorescence, chromogenic, or radioisotopic detection)

ويوجد  العديد من البرامج الجديدة التى تساعدنا فى عملية تحليل البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى بالمضيء الكيميائي المحسن Enhanced chemiluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.

كما يتم أحياناً استخدام طريقة الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection حيث يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة مسقبلات ضوئية مثل كاميرات السي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب.

حيث تقوم تلك الكاميرات باستقبال الضوء المنبعث وألتقاط صورة رقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن.

6- مرحلة التحليل Analysis

الاشارات التى يتم استقبالها باستخدام الفيلم الفوتوغرافي او الكاميرات تتسبب فى تكوين مجموعة نطاقات من البروتينات على الغشاء. ويمكن من خلالها تقدير الوزن الجزيئي للبروتينات كما يمكن تحديد كمياتها.

لمزيد من التوضيح لمراحل تحليل ويسترن بلوت، يمكن قراءة مقالتنا لطخة ويسترن: المفهوم، مراحل التنفيذ، وأهم التطبيقات

المعمل الافتراضي لتجربة ويسترن بلوت

توفر معامل براكسيلابس المحاكاة الافتراضية لتجربة ويسترن بلوت .. أنشئ حسابك المجاني وجربها الآن

الأسئلة الشائعة حول تحليل ويسترن بلوت

ما الفرق بين إليزا وويسترن بلوت؟

يستخدم اختبار ELISA إنزيمات أو أجسامًا مضادة متصلة بسطح صلب لإنشاء سطح الاختبار. ثم تضاف عينة إلى سطح الاختبار. تشير الأجسام المضادة أو الإنزيمات التي تتفاعل أو ترتبط بالبروتينات إلى نتيجة إيجابية.

ولكن بدلاً من استخدام الأجسام المضادة للكشف عن مستضد الفيروس ، فإنها تستخدم مستضد الفيروس للكشف عن الأجسام المضادة. يشير اختبار ELISA الإيجابي إلى وجود جسم مضاد للفيروس في مريضنا. قد يكون هذا المريض مصابًا بعدوى فيروسية استجاب لها جهاز المناعة. في كثير من الأحيان ، هذا يعني أنه ليس لديهم فيروس حي ، وسوف يتعافون. نظرًا لأن الأجسام المضادة يمكن أن تستمر لفترة من الوقت بعد حدوث عدوى فيروسية ، يمكن لـ ELISA اكتشاف العدوى التي حدثت منذ فترة.

يتم إجراء اختبار ويسترن بلوت بعد الفصل الكهربائي للهلام. يتم نقل البروتينات المنفصلة (أو تنشيفها) إلى أغشية النيتروسليلوز أو النايلون ويتم التعرف عليها بواسطة أجسام مضادة محددة يتم تمييزها بواسطة بروتين ثانوي.

يكتشف المستضدات الفيروسية (بروتينات عادة على سطح الفيروسات) باستخدام الأجسام المضادة ضد تلك البروتينات. تشير البقعة الغربية الإيجابية إلى وجود مستضد فيروسي والذي يعني في كثير من الأحيان فيروس حي و قد يكون هذا المريض مصابًا بعدوى فيروسية مستمرة.

الى اي مدى تصل دقة تحليل ويسترن بلوت؟

قد يستغرق الجهاز المناعي مدة تصل إلى شهرين لإنتاج الأجسام المضادة بعد أن لدغها قراد يحمل بكتيريا B. burgdorferi.

وقد يستغرق الأمر ما يصل إلى 3 أشهر قبل إنتاج الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية بعد التعرض.

نظرًا لأن تحليل ويسترن بلوت يتحقق من وجود الأجسام المضادة، فقد يعطي نتائج سلبية خاطئة لكلا الشرطين إذا تم إعطاؤه في وقت مبكر جدًا.

في بعض الحالات ، قد تتسبب بعض الحالات مثل الذئبة أيضًا في حدوث نتائج إيجابية خاطئة.

كم من الوقت تحتاج لمعرفة نتيجة تحليل ويسترن بلوت؟

تستغرق تحليل أو اختبار ويسترن بلوت يومًا واحدًا فقط ، لكن بعض المعامل قد لا تجري الاختبار كل يوم. عادة ما تكون نتائج الاختبارات السريعة التي يتم إجراؤها في مكتب أخصائي الرعاية الصحية أو في نقاط أخرى للرعاية متاحة في غضون 15-20 دقيقة.

ما هي استخدامات تحليل ويسترن بلوت؟

يستخدم اختبار ويسترن بلوت لتأكيد أو معارضة تشخيص فيروس نقص المناعة البشرية أو مرض لايم بعد أن يظهر اختبار الأجسام المضادة ELISA إيجابيًا أو سلبيًا. نظرًا لأن اختبار ELISA ينتج أحيانًا نتائج إيجابية خاطئة ، يلزم إجراء اختبار ثانٍ لتعزيز التشخيص.

إذا كان الشخص  مصابًا بمرض لايم ، فقد يكتشف اختبار لطخة ويسترن الأجسام المضادة لـ B. burgdorferi ، البكتيريا التي تسبب هذه الحالة.و إذا كان مصابًا بفيروس نقص المناعة البشرية ، فقد يكتشف تحليل ويسترن بلوت البروتينات من غلاف أو قلب الفيروس والإنزيمات الناتجة عن عدوى فيروس نقص المناعة البشرية.

 

تقدم براكسيلابس معامل العلوم الإفتراضية التى تمكنك من إجراء العديد من التجارب فى العلمية فى الكيمياء والفيزياء والبايولوجيا عبر الانترنت فى اى وقت ومكان .. سجل الآن وانضم الينا!

 

عن نورهان عصام

نورهان عصام

شاهد أيضاً

تقنية الاليزا : المفهوم، الأنواع، مبدأ العمل، الاستخدامات، الإيجابيات والسلبيات

تقنية الاليزا : المفهوم، الأنواع، مبدأ العمل، الاستخدامات، الإيجابيات والسلبيات

تقنية الاليزا Elisa والتي تعرف أيضًا باسم (المقايسة الامتصاصية المناعية للانزيم المرتبط) هي اختبار كيميائي …