كل ما تريد معرفته عن تحليل ويسترن بلوت

ويسترن بلوت والتي تعرف أيضا باللطخة المناعي (Immunoblot) هي طريقة اكتشاف بروتين معين في عينة أو مستخلص أنسجة، وهي من التقنيات الحيوية المخبرية. تستخدم الفصل الكهربائي للهلام لفصل البروتينات الطبيعية أو البروتينات المُتَنسِّخة حسب طول السلاسل البروتينية أو حسب الشكل الثلاثي الأبعاد للبروتين.

والغرض الأساسي من إجراء تجربة لطخة ويسترن هو الكشف عن بروتين محدد داخل العينة التى تحتوى على بروتينات مختلفة، وتمكن الباحثون من التعرف على بروتينات محددة من وسط تراكيب بروتينية معقدة من الخلية.

كما أنها تزودنا بالكثير من المعلومات التفصيلية حول حجم هذا البروتين ووفرته النسبية داخل العينة المراد فحصها.

قم بتجربه ويسترن بلوت فى مختبر براكسيلابس الافتراضي الان

 

تحليل ويسترن بلوت

 

ما هو تحليل ويسترن بلوت

تم اختراع تحليل ويسترن بلوت في عام 1979 لهدف تحديد بروتينات ربط الحمض النووي الريبي الريبوزومي.

يتم عمل تحليل لطخة ويسترن في حالة الحصول على نتيجة إيجابية لداء لايم أو فيروس نقص المناعة البشرية، فقد يوصي الطبيبب باختبار لطخة ويسترن بعد اجراء تحليل اليسا (ELISA)

يبحث تحليل ويسترن بلوت عن الأجسام المضادة للعدوى، وليس العدوى نفسها، فعند اصابة الجسم بعدوى فيروسية أو فطرية أو بكتيرية ، فإنه سينتج بروتينات تسمى المستضدات استجابةً لذلك. تحفز المستضدات جهاز المناعة لطرد الأجسام المضادة في محاولة لمكافحة المرض.

اجراءات عمل تحليل ويسترن بلوت

اجراءات عمل تحليل ويسترن بلوت

  • اختبار لطخة ويسترن هو اختبار دم بسيط. لا يتطلب صياماً أو تحضيرًا بأي شكل من الأشكال.
  • مثل جميع اختبارات الدم ، قد تحتاج إلى ملء نموذج الموافقة أولاً.
  • يتم سحب عينة الدم في المختبر، ومن ثم ستحصل على نتائج الاختبار في غضون 4 أو 5 أيام عمل.
  • تمامًا مثل جميع اختبارات الدم ، لا توجد آثار جانبية خطيرة يمكن توقعها. قد يكون لديك قدر طفيف من الكدمات في موقع سحب الدم.

خطوات تحليل لطخة ويسترن Western blot analysis

الآن سنعرف كيف يتم تشخيص تحليل لطخة ويسترن؟

1- تحضير العينة Preparing the Sample

يعد تحضير ووضع العينة في المادة الهلامية هو أول خطوات التجربة. يمكن للعينة أن تكون عبارة عن خلية، أو نسيج حيوي، أو سائل معين نرغب في استخلاص بروتين محدد منه بهدف دراسته وفحصه.

2- الفصل الكهربائي للهلام Proteins’ Electrophoretic Separation 

الفصل الكهربائى للهلام يعرف كعملية فصل للبروتينات وفقًا لخواص معينة على الهلام. تتم هذه العملية عن طريق استدراج البروتينات نحو أقطاب كهربائية تفصل بروتينات محددة ضمن الهلام، وذلك لتحضيرها وإعدادها لاستخدامات أخرى.
بعد تجهيز العينة وتحميلها على الهلام بهدف فصل البروتينات حسب حجمها، تفصل العينات المشحونة عن طريق توليد مجال كهربي أعلى الهلام.

3- نقل البروتينات إلى الغشاء Transferring Proteins to the Membrane

المرحلة التالية هي مرحلة نقل البروتين إلى غشاء متين أكثر من سابقه. نحتاج في هذه الخطوة إلى عدة أشياء، وهي: إسفنج، و ورق ترشيح، ومادة هلامية، وغشاء متين يوضع بين المادة الهلامية وقطب البطارية الموجب.

4- مرحلة السد Blocking Nonspecific Sites

يتم اختيار الغشاء وفقًا لقابليته وقدرته على الالتصاق بالبروتينات. بما أن الأجسام المضادة والبروتينات المستهدفة هي في الأصل عبارة عن بروتينات، فإنه من الضرورى أن تؤخذ بعض الاحتياطات لتجنب ومنع التفاعل بين الغشاء والجسم المضاد المستخدم في اكتشاف البروتين المستهدف.

لمنع الالتصاق، يوضع الغشاء في محلول مخفف من البروتين الذي يؤدي إلى حدوث عملية الالتصاق بالغشاء في الأماكن التى لا تحتوي على أي من البروتينات المستهدفة. إذًا فإنه بعد إضافة الجسم المضاد، سوف تلتصق الأجسام المضادة مباشرة بالأماكن التى يوجد بها البروتين المستهدف، حيث لن يكون هناك مكان آخر يمكنها الالتصاق به.

5- الاكتشاف Detection Methods

نقوم بالتأكد من وجود البروتينات المستهدفة على الغشاء أثناء عملية الاكتشاف. يتم ذلك عن طريق الإستعانة بجسم مضاد معدل مرتبط بإنزيم مراسل، والذي يسبب تفاعلًا لونيًا عند وضع مادة معينة عليه منتجًا بذلك لونًا معينًا. ينقسم تنفيذ هذه الخطوة إلى مرحلتين، حيث يُكتشَف البروتين على الغشاء بطرق عديدة، وهي:

  1. chemiluminescence
  2. chemifluorescence
  3. fluorescence
  4. chromogenic
  5. radioisotopic detection

يوجد العديد من البرامج الجديدة التى تساعدنا فى عملية تحليل البيانات بصورة أخرى مثل تحليل الوزن الجزيئي إذا تم استخدام مقاييس صحيحة. يعتبر ما يسمى بالمضيء الكيميائي المحسن Enhanced chemiluminscent أو ECL هو من ضمن أكثر الطرق حساسية للاكتشاف التحليلي للطخة ويسترن.

كما يتم أحياناً استخدام طريقة الاكتشاف الفلوري Fluorescent detection حيث يتم تحفيز الملتقط ذو العلامات الفلورية بواسطة الضوء والانبعاث من التحفيز وبذلك يتم الاستدلال عليه بواسطة مسقبلات ضوئية مثل كاميرات السي سي دي المزودة بمرشح باعث مناسب. حيث تقوم تلك الكاميرات باستقبال الضوء المنبعث وألتقاط صورة رقمية للطخة ويسترن ويقوم بالسماح لتحليل بيانات أخرى كالوزن الجزيئي والتحليل الكمي للطخة ويسترن.

6- التحليل Analysis

تتسبب الإشارات التى يتم استقبالها باستخدام الفيلم الفوتوغرافي أو الكاميرات في تكوين مجموعة نطاقات من البروتينات على الغشاء. يُقدر الوزن الجزيئي للبروتينات من خلال هذه النطاقات، كما تُمكننا أيضًا من تحديد كمية البروتينات.

لمزيد من التوضيح لمراحل تحليل ويسترن بلوت، يمكن قراءة مقالتنا لطخة ويسترن: المفهوم، مراحل التنفيذ، وأهم التطبيقات

توفر معامل براكسيلابس المحاكاة الافتراضية لتجربة ويسترن بلوت .. أنشئ حسابك المجاني وجربها الآن

الأسئلة الشائعة حول تحليل ويسترن بلوت

ما الفرق بين إليزا وويسترن بلوت؟

يستخدم اختبار ELISA إنزيمات أو أجسامًا مضادة متصلة بسطح صلب لإنشاء سطح الاختبار. ثم تضاف عينة إلى سطح الاختبار. تشير الأجسام المضادة أو الإنزيمات التي تتفاعل أو ترتبط بالبروتينات إلى نتيجة إيجابية.

ولكن بدلاً من استخدام الأجسام المضادة للكشف عن مستضد الفيروس ، فإنها تستخدم مستضد الفيروس للكشف عن الأجسام المضادة. يشير اختبار ELISA الإيجابي إلى وجود جسم مضاد للفيروس في مريضنا. قد يكون هذا المريض مصابًا بعدوى فيروسية استجاب لها جهاز المناعة. في كثير من الأحيان ، هذا يعني أنه ليس لديهم فيروس حي ، وسوف يتعافون. نظرًا لأن الأجسام المضادة يمكن أن تستمر لفترة من الوقت بعد حدوث عدوى فيروسية ، يمكن لـ ELISA اكتشاف العدوى التي حدثت منذ فترة.

يتم إجراء اختبار ويسترن بلوت بعد الفصل الكهربائي للهلام. يتم نقل البروتينات المنفصلة (أو تنشيفها) إلى أغشية النيتروسليلوز أو النايلون ويتم التعرف عليها بواسطة أجسام مضادة محددة يتم تمييزها بواسطة بروتين ثانوي.

يكتشف المستضدات الفيروسية (بروتينات عادة على سطح الفيروسات) باستخدام الأجسام المضادة ضد تلك البروتينات. تشير البقعة الغربية الإيجابية إلى وجود مستضد فيروسي والذي يعني في كثير من الأحيان فيروس حي و قد يكون هذا المريض مصابًا بعدوى فيروسية مستمرة.

الى اي مدى تصل دقة تحليل ويسترن بلوت؟

قد يستغرق الجهاز المناعي مدة تصل إلى شهرين لإنتاج الأجسام المضادة بعد أن لدغها قراد يحمل بكتيريا B. burgdorferi.

وقد يستغرق الأمر ما يصل إلى 3 أشهر قبل إنتاج الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية بعد التعرض.

نظرًا لأن تحليل ويسترن بلوت يتحقق من وجود الأجسام المضادة، فقد يعطي نتائج سلبية خاطئة لكلا الشرطين إذا تم إعطاؤه في وقت مبكر جدًا.

في بعض الحالات ، قد تتسبب بعض الحالات مثل الذئبة أيضًا في حدوث نتائج إيجابية خاطئة.

كم من الوقت تحتاج لمعرفة نتيجة تحليل ويسترن بلوت؟

تستغرق تحليل أو اختبار ويسترن بلوت يومًا واحدًا فقط ، لكن بعض المعامل قد لا تجري الاختبار كل يوم. عادة ما تكون نتائج الاختبارات السريعة التي يتم إجراؤها في مكتب أخصائي الرعاية الصحية أو في نقاط أخرى للرعاية متاحة في غضون 15-20 دقيقة.

ما هي استخدامات تحليل ويسترن بلوت؟

يستخدم اختبار ويسترن بلوت لتأكيد أو معارضة تشخيص فيروس نقص المناعة البشرية أو مرض لايم بعد أن يظهر اختبار الأجسام المضادة ELISA إيجابيًا أو سلبيًا. نظرًا لأن اختبار ELISA ينتج أحيانًا نتائج إيجابية خاطئة ، يلزم إجراء اختبار ثانٍ لتعزيز التشخيص.

إذا كان الشخص  مصابًا بمرض لايم ، فقد يكتشف اختبار لطخة ويسترن الأجسام المضادة لـ B. burgdorferi ، البكتيريا التي تسبب هذه الحالة.و إذا كان مصابًا بفيروس نقص المناعة البشرية ، فقد يكتشف تحليل ويسترن بلوت البروتينات من غلاف أو قلب الفيروس والإنزيمات الناتجة عن عدوى فيروس نقص المناعة البشرية.

 

تقدم براكسيلابس معامل العلوم الإفتراضية التى تمكنك من إجراء العديد من التجارب العلمية فى الكيمياء والفيزياء والبايولوجيا عبر الانترنت فى اى وقت ومكان .. سجل الآن وانضم الينا!

 

ابدا تجاربك مع براكسيلابس الان مجانا!

عن نورهان عصام

شاهد أيضاً

إنزيم المستحرة المائية واستخداماته المتعددة

إنزيم المستحرة المائية: مفتاحك إلى اختبار PCR

اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (اختصارًا PCR) هو طريقة لتضخيم تسلسل معين من الحمض النووي باستخدام …